用Scater包分析文章数据
课程笔记
粉丝：有单细胞线上课程吗？
小编：什么
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希望大家能有所收获！
序
第三单元第九讲：使用Scater包
首先再次了解文章数据
单细胞转录组学习笔记-4-获取Github代码包以及准备工作
载入数据，创建对象
1rm(list = ls())
2Sys.setenv(R_MAX_NUM_DLLS=999)
3## 首先载入文章的数据
4load(file='../input.Rdata')
5# 原始表达矩阵
6counts=a
7counts[1:4,1:4];dim(counts) # 2万多个基因，768个细胞
8library(stringr)
9# 样本信息
10meta=df
11> head(meta)
12 g plate n_g all
13SS2_15_0048_A3 1 0048 2624 all
14SS2_15_0048_A6 1 0048 2664 all
15SS2_15_0048_A5 2 0048 3319 all
16SS2_15_0048_A4 3 0048 4447 all
17SS2_15_0048_A1 2 0048 4725 all
18SS2_15_0048_A2 3 0048 5263 all
Scater需要利用SingleCellExperiment这个对象（需要注意的是，官方友情提示，在导入对象之前，最好是将表达量数据存为矩阵）
1options(warn=-1) # 全局关闭warning信息
2suppressMessages(library(scater))
3## 创建 scater 要求的对象
4sce <- SingleCellExperiment(
5 assays = list(counts = as.matrix(counts)),
6 colData = meta
7)
8
9> sce
10class: SingleCellExperiment
11dim: 24582 768
12metadata(0):
13assays(1): counts
14rownames(24582): 0610005C13Rik 0610007P14Rik ... ERCC-00170
15 ERCC-00171
16rowData names(0):
17colnames(768): SS2_15_0048_A3 SS2_15_0048_A6 ... SS2_15_0049_P22
18 SS2_15_0049_P24
19colData names(4): g plate n_g all
20reducedDimNames(0):
21spikeNames(0):
预处理
如果要计算CPM值，之前一直使用log2(edgeR::cpm(dat)+1)进行计算，这个包自己做了一个函数：calculateCPM()
1exprs(sce) <- log2(calculateCPM(sce ) + 1)
2# 计算结果保存在
3> assayNames(sce)
4[1] "counts" "logcounts"
5# 然后取出来计算结果也很简单
6> counts(sce)[1:3,1:3]
7 SS2_15_0048_A3 SS2_15_0048_A6 SS2_15_0048_A5
80610005C13Rik 0 0 0
90610007P14Rik 0 0 18
100610009B22Rik 0 0 0
11> logcounts(sce)[1:3,1:3]
12 SS2_15_0048_A3 SS2_15_0048_A6 SS2_15_0048_A5
130610005C13Rik 0 0 0.000000
140610007P14Rik 0 0 6.458664
150610009B22Rik 0 0 0.000000
注意：表达矩阵的标准命名中，
exprs和logcounts是同义词，它是为了和老版本的scater函数兼容1> identical(exprs(sce), logcounts(sce))
2[1] TRUE
拿到基因名，检测是否存在线粒体基因、ERCC spike-in（利用feature信息对细胞进行质控）
1genes=rownames(rowData(sce))
2> length(genes[grepl('^MT-',genes)])
3[1] 0
4> length(genes[grepl('^ERCC-',genes)])
5[1] 92
6# 这也是标准的ERCC，目前赛默飞公司提供的就设置了92个不同长度和GC含量的细菌RNA序列
利用calculateQCMetrics函数进行QC：
1# 官方给定的写法是：
2example_sce <- calculateQCMetrics(example_sce,
3 feature_controls = list(ERCC = 1:20, mito = 500:1000),
4 cell_controls = list(empty = 1:5, damaged = 31:40))
5# 这里添加feature_controls信息即可
6sce <- calculateQCMetrics(sce,
7 feature_controls = list(ERCC = grep('^ERCC',genes)))
之后过滤：
1# 至少在5个细胞中有表达量的基因可以留下
2keep_feature <- rowSums(exprs(sce) > 0) > 5
3> table(keep_feature)
4keep_feature
5FALSE TRUE
610427 14155
7sce <- sce[keep_feature,]
8# 然后看看细胞中总表达量
9boxplot(sce$total_features_by_counts )
10# 根据下图设置总表达量低于2000的细胞被舍去
11keep.n <- sce$total_features_by_counts > 2000
12filtered_sce <- sce[,keep.n]
13# 最终过滤了一万多基因，几十个细胞
14> dim(filtered_sce)
15[1] 14155 693
对过滤的结果可视化
首先调几个基因看看基因表达量和384孔板这个批次有没有关系：
1plotExpression(sce, rownames(sce)[1:6],
2 x = "plate", exprs_values = "logcounts")
另外简单看看高表达基因的占比：
默认显示前50个基因。图中每一行表示一个基因，每个线条(bar)表示这个基因在不同细胞的表达量(可以想象成把基因表达量的箱线图转了一下)。圆圈是每个基因表达量的中位数，并且在图中经过了排序。
1plotHighestExprs(sce, exprs_values = "counts")
图中可以发现top50中很多ERCC的存在，但是看到第一个ERCC在很多样本中占比超过了15%，也就是说那些样本中有超过15%的reads都”浪费“在了这种不相关的外源序列上，减少了自身的比对量
降维1-PCA分析
默认情况下，runPCA会根据500个变化差异最显著的feature的log-count值进行计算，当然这个数量可以通过ntop参数修改。
1sce <- runPCA(sce)
2plotPCA(sce)
3# SingleCellExperiment对象中包含了reducedDims接口，其中存储了细胞降维后的坐标，可以用reducedDim、reducedDims函数获取，而具体降维的名称用reducedDimNames获取
4> reducedDimNames(sce)
5[1] "PCA"
这样的结果需要再加上表型信息，才能看出来是否有批次效应
1plotReducedDim(sce, use_dimred = "PCA",
2 shape_by= "plate",
3 colour_by= "g")
可以看到，四组层次聚类结果在PCA中也能够分开，并且每组细胞都含有两个细胞板信息，细胞板混杂在一起说明没有批次效应
降维2-tSNE
注意：tsne只是一种降维的方法，最后只给出一个坐标。根据坐标是能明白这一群和那一群能分得开，但还不能确定这一群就是单独的一组。为了找到这个依据，就是要进行聚类
1set.seed(1000)
2sce <- runTSNE(sce, perplexity=10)
3plotTSNE(sce,
4 shape_by= "plate",
5 colour_by= "g")
从图中可以看到，之前用层次聚类定义的4群细胞，现在主要有3群（第1群和第2群混在了一起）
降维3- DiffusionMap
1sce <- runDiffusionMap(sce)
2plotDiffusionMap(sce,
3 shape_by= "plate",
4 colour_by= "g")
5
6# 此时sce也记录了，做过三次降维处理，但每次都不冲突，存储在平行位置
7> sce@reducedDims
8List of length 3
9names(3): PCA TSNE DiffusionMap
聚类1-K-means
以t-SNE结果为例
1# 提取tsne降维后的主成分坐标，这个坐标就相当于一个新的矩阵，只不过不记录表达量而记录坐标(供后续聚类使用)
2> head(sce@reducedDims$TSNE,3)
3 [,1] [,2]
4[1,] 13.99815 -17.82133
5[2,] 14.94079 -14.26358
6[3,] 10.63692 -23.44417
7# Kmeans需要的参数主要是：一个数值矩阵，一个自定义的分群数量
8kmeans(sce@reducedDims$TSNE,centers = 4)
9# 它的结果主要包含：
10# Available components:
11[1] "cluster" "centers" "totss" "withinss"
12[5] "tot.withinss" "betweenss" "size" "iter"
13[9] "ifault"
14
15# 我们选择第一个”cluster“，就是记录的分组信息
16> head(kmeans(sce@reducedDims$TSNE,centers = 4)$cluster)
17[1] 4 4 4 3 1 3
18# 最后将分组信息添加到sce的表型信息中
19colData(sce)$tSNE_kmeans <- as.character(kmeans(sce@reducedDims$TSNE,
20 centers = 4)$cluster)
21plotTSNE(sce, colour_by = "tSNE_kmeans")
聚类2-层次聚类hclust：
1# 重点：将tsne的结果当成一个矩阵即可，让其中的坐标分成4群就行
2hc=hclust(dist( sce@reducedDims$TSNE ))
3clus = cutree(hc, 4)
4colData(sce)$tSNE_hc <- as.character(clus)
5plotTSNE(sce, colour_by = "tSNE_hc")
聚类3-SC3包
另外，有个R包SC3 也提供了聚类的算法，是基于K-means的，用一下试试
1library(SC3) # BiocManager::install('SC3')
2sce <- sc3_estimate_k(sce) # 先预估一下聚类亚群
3sce@metadata$sc3$k_estimation # 预估13个亚群
4rowData(sce)$feature_symbol <- rownames(rowData(sce))
5
6# 接下来正式运行，kn参数表示的预估聚类数
7# 我们这里自定义为4组
8kn <- 4
9start=Sys.time()
10sce <- sc3(sce, ks = kn, biology = TRUE) # 运行会很慢
11end=Sys.time()
12(dur=end-start)
13# 总共需要5分钟左右
14
15# 会将聚类结果放入表型信息(sce@colData)中去，默认叫sc3_cluster，这里人为改个名称
16sc3_cluster="sc3_4_clusters"
17# 最后进行可视化--比较之前tSNE的Kmeans聚类和SC3的聚类的一致性
18sc3_plot_consensus(sce, k = kn, show_pdata = c("tSNE_kmeans",sc3_cluster))
再用table函数看看二者分群的相关性：
1> table(colData(sce)$tSNE_kmeans,colData(sce)$sc3_4_clusters)
2
3 1 2 3 4
4 1 14 42 44 6
5 2 194 0 0 0
6 3 36 147 0 7
7 4 278 0 0 0
同理，也能看看SC3结果与hclust的聚类相关性
1sc3_plot_consensus(sce, k = kn, show_pdata = c("g",sc3_cluster))
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